Pipeline de Anotação de Variante (NGS)

Pipeline reprodutível para análise de variantes genômicas utilizando dados de sequenciamento de nova geração (NGS), desde o controle de qualidade das reads até a anotação funcional e clínica das variantes.

Todo o ambiente foi containerizado em Docker para garantir reprodutibilidade e consistência entre diferentes sistemas operacionais.

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Objetivo

Este projeto foi desenvolvido para implementar um pipeline completo de análise de variantes utilizando ferramentas amplamente empregadas em bioinformática.

O workflow contempla:

• Controle de qualidade das reads
• Alinhamento ao genoma de referência
• Processamento de arquivos BAM
• Chamada de variantes
• Normalização das variantes
• Anotação clínica e funcional
• Análise exploratória dos resultados em Python

Além da execução do pipeline, o projeto teve como foco compreender o propósito de cada etapa, interpretar os resultados produzidos e construir um fluxo reproduzível utilizando Docker.

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Tecnologias utilizadas

Bioinformática

Ferramenta	Finalidade
Fastp	Controle de qualidade e filtragem das reads
BWA-MEM	Alinhamento das reads ao genoma de referência
SAMtools	Conversão, ordenação e indexação de arquivos BAM
BCFtools	Chamada e manipulação de variantes
vt	Normalização e decomposição das variantes
Ensembl VEP	Predição do impacto funcional das variantes
ClinVar	Informações sobre relevância clínica das variantes

Infraestrutura

• Docker
• Miniconda
• Linux
• Bash

Análise de dados

• Python
• Pandas
• Matplotlib

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Referência genômica

• Genoma de referência: GRCh38
• Cromossomo analisado: 20

Para reduzir o tempo computacional e facilitar a reprodução do pipeline, foi utilizado apenas o cromossomo 20 como conjunto de dados de demonstração.

O genoma foi indexado utilizando:

• samtools faidx
• bwa index

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Workflow

graph TD
    A[FASTQ] --> B(Quality Control - Fastp)
    B --> C(Subsample)
    C --> D(BWA-MEM)
    D --> E(SAMtools)
    E --> F(BCFtools)
    F --> G(vt)
    G --> H(ClinVar)
    H --> I(VEP)
    I --> J(Python Analysis)

Loading

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Resultados

Após a execução do pipeline foram identificadas 3.133 variantes no cromossomo 20.

As variantes passaram por anotação clínica (ClinVar) e funcional (VEP), permitindo avaliar tanto sua relevância clínica quanto seu possível impacto biológico.

Registro clínico

Classificação	Quantidade
Total de variantes	3133
Com registro no ClinVar	47
Sem registro clínico	3086

Entre as variantes registradas:

Classificação	Quantidade
Benign	24
Likely benign	10
Uncertain significance	10
Benign / Likely benign	2
Conflicting classifications	1

A maior parte das variantes registradas possui classificação benigna, indicando ausência de associação conhecida com doenças.

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Impacto funcional

Segundo a anotação realizada pelo Ensembl VEP:

• 100% das variantes receberam classificação MODIFIER

Isso indica que as variantes identificadas estão predominantemente localizadas em regiões não codificantes ou apresentam impacto funcional baixo ou ainda desconhecido.

Nenhuma variante foi classificada como HIGH ou MODERATE.

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Distribuição genômica

A distribuição das variantes ao longo do cromossomo mostrou cobertura em praticamente toda sua extensão, com maior concentração próxima à região de 30 Mb.

Essa concentração pode estar relacionada à cobertura do sequenciamento ou à maior densidade de variantes naquela região.

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Principais competências demonstradas

Este projeto demonstra experiência prática em:

• Desenvolvimento de pipelines em Bioinformática
• Linux e linha de comando
• Docker para reprodutibilidade
• Processamento de arquivos FASTQ, BAM e VCF
• Variant Calling
• Anotação funcional de variantes
• Interpretação de resultados de NGS
• Organização de workflows reproduzíveis
• Análise de dados em Python

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Próximos passos

• Implementação de workflow utilizando Nextflow ou Snakemake